Įranga

Fluorescencijos gesimo laikos spektrometras Edinburgh Instruments FL920
FLS920-t tai modulinis laikinės skyros fluorescencijos spektrometras valdomas kompiuteriu.
L geometrijos, laike koreliuotų pavienių fotonų skaičiavimo (LKPFS) pagrindu veikiantis spektrometras gali matuoti laikinės skyros liuminescencijos spektrus bei liuminescencijos kinetikas besitesiančias nuo 100 pikosekundžių iki 10 mikrosekundžių. LKPFS metodika leidžia pasiekti itin aukštą tikslumą bei laikinę rezoliuciją. 

Fotoelektronų kamera
Fotoelektronų kamera (angliškai „Streak camera“), tai laikinės skyros fluorescencijos registravimo įrenginys, kurio veikimas panašus į analoginį oscilografą. Fotoelektronų kamera pranašesnė už kitus fluorescencijos matavimo prietaisus tuo, jog galima greitai išmatuoti visą norimą spektrą su laiko dedamąja. Sistemoje naudojama „Hamamatsu“ fotoelektronų kamera pasižymi itin didele laikine skyra ~1,9ps. Pagrindinė šios kameros idėja – elektronų srauto trajektoriją išlenkti kintančiu elektriniu lauku. Šis elektrinis laukas pastoviai stiprėja, todėl vėliausiai atkeliavusių elektronų trajektorijos bus smarkiausiai užlenktos. Kadangi elektronai yra lenkiami tik vertikaliąja kryptimi, horizontalioji kryptis gali būti išnaudojama spektrinei informacijai (200-1600nm bangos ilgio spektrui). Taip mes vienu metu galime užfiksuoti visą spektrą su itin gera laikine skyra. Fotoelektronų kamera itin naudinga ten kur bandiniai greitai degraduoja ar norint išmatuoti tik pačią bandinio sužadinimo gesimo pradžią.
Sistema naudoja ~3W optinės galios, 1030nm bangos ilgio lazerį („Pharos“ osciliatorius) ir generuojant antrą, trečią ir ketvirtą harmonikas(„Hiro“ harmonikų generatorius) iš netiesinio kristalo galima gauti 515nm, 343nm, 257nm bangos ilgio impulsus. Lazerio generuojamų impulsų dažnis 76MHz, o impulsų trukmė ~80fs, tačiau naudojant pokelso elementą galima gauti 10kHz pasikartojimų dažnį.

2D spektrometro stendas
2D spektrometro stendas šiuo metu yra surinkinėjamas. Daugiau informacijos artimiausiu metu. 

Žadinimo-zondavimo stendas
Žadinimo-zondavimo metodas yra tikriausiai dažniausiai naudojamas ultrasparčios spektroskopijos metodas. Jo pagrindinė idėja labai parasta, metodui reikalingi du trumpi lazerio impulsai: intensyvus „žadinimo“ impulsas, kuris sukelia fotoreakciją tiriamame bandinyje ir mažesnio intensyvumo „zondavimo“ impulsas su kuriuo galima tirti žadinimo impulso sukeltą sugerties pokytį. Zondavimo impulsas, naudojantis mechanine vėlinimo linija gali būti vėlinamas žadinimo impulso atžvilgiu ir atitinkamai sugerties pokyčiai gali būti išmatuoti esant įvairiems laiko tarpams tarp žadinimo ir zondavimo impulsų. Tokiu būdu išmatuota sugerties pokyčio dinamika atspindi procesus, kurie vyksta sužadintų molekulių relaksacijos metu.
Žadinimo-zondavimo spektrometras paremtas femtosekundiniu „Pharos 10-600-PP” lazeriu (Šviesos konversija), kuris generuoja 290 fs trukmės, 1028 nm bangos ilgio, 200 kHz pasikartojimo dažnio impulsus. Optinis parametrinis generatorius „Orpheus PO15F2L“ (Šviesos konversija) naudojamas norimo žadinančio impulso bangos ilgio nustatymui. 2 mm storio safyro arba kalcio fluorido langelis naudojamas sugeneruoti baltos šviesos kontinuumą, kuris naudojamas kaip zonduojantis impulsas.

KARS mikroskopas
KARS mikroskopija – tai bežymeklinė technologija, kurios kontrasto mechanizmas pagrįstas molekulių vibracijomis. KARS metodo jautris keliomis eilėmis lenkia spontaninio Ramano mikroskopiją. Netiesinis KARS atsakas leidžia gauti 3D vaizdus nenaudojant konfokalinės konfigūracijos. Anti-Stokso signalas yra pasislinkęs į mėlynąją spektro pusę, taigi išvengiama vienfotonės fluorescencijos fono.
Mūsų laboratorijoje surinktas KARS mikroskopas naudoja dviejų bangų ilgių lazerinį šaltinį ir skenuojantį mikroskopą. Lazeris suideda iš pikosekundinio, padvigubinto dažnio Nd:YVO4 kaupinimo lazerio veikiančio 1 MHz pasikartojimo dažniu ir bėgančios bangos optinio parametrinio generatoriaus (OPG), leidžiančio zonduoti 700 – 4500 cm-1 diapazoną. Mūsų KARS schemoje sudvejinti OPG (6 ps) ir Nd:YVO4 (1064 nm) signalai naudojami kaip žadinimo ir Stokso spinduliai atitinkamai.

Pavienių molekulių mikroskopas/spektrometras
Turimu pavienių molekulių fluorescenciniu mikrospektrometru įmanoma registruoti individualių fluorescuojančių ant paviršiaus imobilizuotų molekulių spektrus ir jų dinamiką. Tai gali būti atliekama dviem būdais:

• Žadinant plačią paviršiaus sritį visiško vidaus atspindžio konfigūracijoje ir registruojant fluorescencijos signalą iš daugelio individualių molekulių lygiagrečiai. Šituo būdu fluorescencijos signalas išskaidomas į dvi spektrines komponentes. Laikinė skyra yra ne geresnė nei maždaug video dažnio. Pagrindinis privalumas – didelio molekulių skaičiaus tyrimas lygiagrečiai. Tinka, pvz., stebėti FRET fluorescuojančių donoro-akceptoriaus dažų poroje [1]. 

• Žadinant individualias molekules konfokalinėje modoje ir registruojant fluorescencijos signalą iš pavienių molekulių viena po kitos. Šiuo būdo geresnė laikinė skyra ir įmanomas pilno fluorescencijos spektro registravimas. Registruojant visą spektrą, laikinė skyra siekia kelias ms, o apsiribojant dviemis spektrinėmis komponentėmis, kaip pirmuoju būdu, laikinė skyra siekia dešimtis ns.Be to, konfokalinėje modoje įmanoma registruoti fluorescencijos pliūpsnius iš laisvai tirpale difunduojančių molekulių. Tokiu būdu labai greitai surenkamos didelės statistikinės imtys. Apdorojant duomenis koreliacine analize įmanoma nustatyti, kiek reikšminga yra elektroninės sužadinimo energijos pernaša tiriamos molekulės viduje.

Pastaruoju metu buvo įdiegtas besikeičiančio lazerio žadinimas (ALEX) [2] ir spindulio sukiojimas apatiniame objektyvo fokuso plokštumoje, leidžiantis pasiekti ypač tolygų plataus lauko apšvietimą.

Literatūra:
1. D. Rutkauskas, M. Petkelytė, P. Naujalis, G. Sasnauskas, G. Tamulaitis, M. Zaremba, V. Šikšnys. Restriction enzyme Ecl18kI-induced DNA looping dynamics by single-molecule FRET. Journal of Physical Chemistry B 118, (2014), 8575-8582.
2. Kapanidis AN, Lee NK, Laurence T, Doose S, Margeat E, Weiss S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci. 2004;101: 8936-41.

Inertinių dujų kamera
Ši inertinių dujų kamera skirta atlikti eksperimentus, kuriems būtina izoliacija nuo žalingo aplinkos poveikio. Kamera lengvai pritaikoma konkretiems eksperimentams. Be to, ši kamera yra kompaktiška, lengva ir lengvai transportuojama.

• Skaidri akrilinė viršutinė dalis
• Dvigubos, uždaros korėtos struktūros, oro nepraleidžiančios neopreninės tarpinės tarp viršutinės ir apatinės dalių
• Reguliuojami SS spaustukai leidžia kompensuoti nusidėvėjimą
• 8" O.D. angos su dviem Hypalon® pirštinėm
• Skaidrus, reguliuojamo vakuumo, pernešimo kambarys (12" × 11" Ø)
• Keturi valymo ventiliai – du pernešimo kambaryje, du pagrindiniame skyriuje
• Daugiaskylis elektros lizdas

TEA_MT - intensyvumo bėgant laikui signalų ištraukimo iš fluorescuojančių taškų ir analizės paketasAutorius: Marijonas Tutkus
Bendra informacija

• Analizės paketas parašytas „Igor Pro” kalba.
• Šis analizės paketas gali būti pasidalintas su kituo asmeniu tik turint autoriaus leidimą!

• Programinis paketas buvo parašytas taip kad visos kasdienės pavienių molekulių duomenų analizės užduotys būtų prieinamos vienoje vietoje:
  • Fluorescuojančių taškų aptikimas vaizduose,
  • Kolokalizacija aptiktų fluorescuojančių taškų iš dviejų kanalų,
  • Intensyvumo bėgant lakui signalų ištraukimas iš pasirinkto tipo fluorescuojančių taškų,
  • Ištrauktų signalų filtravimas, bei normalizavimas apšvietimo netolygumui pašalinti,
  • Intensyvumo pasikeitimo taškų aptikimas ištrauktuose signaluose,
  • Aptiktų būsenų charakterizavimas,
  • Patogus rankinis ištrauktų signalų atrinkimas,
  • Automatinis ištrauktų signalų atrinkimas pagal užduotus parametrus,
  • Dvimačių histogramų piešimas iš ištrauktų duomenų.
• Programinis paketas gali naudoti daugelį vaizdinių duomenų formatų.
• Jis taip pat turi vidinę atmintį - įvedus parametro vertę ji bus išsaugota atmintyje, todėl kitą sykį programa prisimins praeitą kart naudotų parametrų vertes.
• Kiekvieną programos dalis išsaugo rezultatus “igor binary” formatu. Yra galimybė greitai ir patogiai konvertuoti juos į “delimited text” formatą.
• Programinis paketas vystytas MacOS aplinkoje, bet puikiai veikia ir naudojant Windows.
• Aš pastoviai atnaujinu šį programinį paketą, todėl pasiūlymai ir komentarai yra labai laukiami: marijonas.tutkus@ftmc.lt